《科学》期刊发表了有关冷冻电镜技术成果 揭开巨细胞病毒脑膜之谜

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巨细胞病毒（human cytomegalovirus ，HCMV）是人类社会的“古老伴侣”，它可利用人类免疫功能下降的时机发起致命打击，对人类健康造成严重危害。 对抵抗力弱的新生儿和儿童而言，HCMV可通过胎盘从母体传染给胎儿，导致严重的新生儿感染。感染后可引起新生儿肝脾肿大、黄疸、脑积水、精神发育迟缓、视网膜破裂、听力丧失等严重的先天畸形，对患儿的终生健康造成不可弥补的损害。对器官移植接受者而言，由于长期服用免疫抑制剂，极易发生HCMV再激活感染，导致严重的移植器官功能衰竭甚至失去。对艾滋病患者而言，由于免疫功能处于低下状态，极易发生各种机会性感染，包括巨细胞病毒在内的各种病毒感染，这可能导致患者的病情迅速恶化乃至死亡。

可以说，因此人们迫切需要研发出有效的疫苗和药物来控制这种感染。然而由于HCMV结构非常复杂，变异性很大，我们对它精确的感染机制知之甚少，这也导致防治策略难以设计；要想研发出有效的防治手段，首先需要解析清楚HCMV的结构基础，HCMV粒子由脑膜、芯片和外膜三层结构组成，其中脑膜是保护病毒基因组的关键蛋白壳层；通过解析HCMV脑膜的精确结构，弄明白脑膜的组成和稳定机制，才能在此基础上设计出针对性的疫苗和药物。因此，解析HCMV脑膜结构是开发防治策略的重要基础。

然而，解析HCMV脑膜结构一直是该领域的难题。首先，HCMV粒子巨大，对准备高质量样本提出了巨大挑战；其次，脑膜本身极其脆弱，传统方法难以保持其原生结构；再次，脑膜组成及相互作用复杂，需要足够高的分辨率进行确定。这些都导致研究者对HCMV脑膜结构知之甚少。

为解决这个难题，美国加州大学洛杉矶分校的周正洪教授团队，通过改进样本制备策略，成功获取了足以进行高分辨分析的病毒样本。并使用直接电子探测技术获取了大量高质量的病毒图像。最终解析出了HCMV分辨率为3.9Å 的完整脑膜结构。该研究成果发表于《科学》期刊上。

具体而言，对于样品制备，由于HCMV的脑膜被一个多形态的病毒外膜包裹，直接进行结构解析会遇到一定困难。研究者使用轻度的去污剂处理病毒颗粒，部分溶解了外膜，这减小了样品的大小，也降低了噪音，有利于获得高分辨率的结构信息；此外，由于脑膜本身比较脆弱，传统制样方法难以保持其原生结构。研究者在溶解外膜后立即准备冷冻电镜样品，使用了优化的冷冻程序，迅速冷冻定型了样品。这样可在最大程度保持脑膜的生理状态的同时进行结构分析。这些精心设计的样品处理流程，既减少了外膜的干扰，又保持了脑膜的原生构象。这种改进的策略对实现HCMV脑膜的高分辨率结构解析起到了关键作用。

图1 运用冷冻电镜技术对HCMV 进行原子模型搭建

研究团队通过冷冻电镜结合图像处理技术，在3.9Å 的近原子分辨率下解析出了HCMV完整的脑膜结构后，对组成脑膜的四种主要蛋白质进行了原子级建模，共确定了62种不同的构象。

通过观察这些结构，研究人员得到一下结论：

1. MCP蛋白结构域的插入模式

图2 HCMV脑膜结构主要蛋白 MCP 的结构展示

MCP作为HCMV脑膜的主要组成蛋白，其复杂的结构域插入模式是本研究的重要发现之一。

研究团队通过对MCP蛋白结构的解析分析发现，它存在着高度复杂的结构域插入模式，这种模式之前只在噬菌体的衣壳蛋白HK97中观察到。MCP蛋白大约由1370个氨基酸组成，可分为上、下两个区域。下区域主要由N端肽链域、二聚化域和Johnson折叠域组成，这个Johnson折叠域是MCP的核心组成部分。而上区域中的上端域、通道域、支撑域和螺旋-转角域等都可看作是对Johnson折叠域的结构域插入。正是这种独特的结构域插入方式，使MCP形成了一个高度复杂的多域蛋白结构，作为HCMV脑膜的主要骨架。

这种结构域的插入对MCP的功能有重要意义。插入结构域增加了MCP蛋白与蛋白之间的相互作用界面，使其更牢固地交联在一起；插入结构域也可起到“楔子”的作用，增强脑膜的机械稳定性。此外，上端域、通道域等的插入，形成了六聚体和五聚体空隙的突出部分，这也是HCMV脑膜的重要结构特征。

所以可以说，MCP蛋白复杂的结构域插入模式是HCMV适应其巨大基因组压力的重要策略之一。这种独特的结构为我们理解HCMV以及其他疱疹病毒的组装机制提供了重要线索。

2. Tri1和Tri2的稳定作用

图3 Tri1 和Tri2的三聚体结合模式稳定脑膜结构

除了MCP蛋白，研究还发现脑膜上存在着另一种三聚体蛋白复合体Tri1和Tri2，它们对增强脑膜的稳定性也起到了重要作用。

Tri1和Tri2可通过自身的聚合形成三聚体环绕在MCP蛋白周围，与MCP紧密接触和互相抱合。这种结构上相互紧密的接触增强了MCP蛋白之间本来相对较弱的相互作用，起到了类似“胶水”的作用，增强了脑膜的整体结构稳定性。

其中Tri2可分为Tri2A和Tri2B两种构象，它们通过长螺旋臂的束合形成紧密的二聚体。Tri1蛋白则可嵌入这种二聚体之间，扣住Tri2二聚体，组成一个稳定的三聚体。这种三聚体可牢固地扣住MCP蛋白，使脑膜结构更加牢固。

所以，这种三聚体的存在也是HCMV适应基因组压力、增强脑膜稳定性的重要手段之一，为我们理解疱疹病毒脑膜的组装机制提供了重要参考。

3. pp150的外部稳定作用

图4 HCMV 特有的pp150蛋白稳定脑膜结构

研究还发现了一种称为pp150的HCMV特异性脑膜蛋白，这种蛋白从外部发挥着重要的脑膜稳定作用。

pp150可以形成螺旋束结构，并通过其保守的半胱氨酸四聚体与另一种小的脑膜蛋白SCP特异性相互作用。每三个pp150分子聚集在一个三聚体上方，并延伸到附近三个MCP蛋白的顶端，这种结构增强了pp150与脑膜的联系。

pp150与SCP的特异性相互作用，使其牢固地锚定在脑膜表面，从外部给予脑膜额外的约束和稳定作用。这种外部约束机制是HCMV独有的，可能是其适应超大基因组压力的一个重要手段。

4.六聚体通道内的DNA

研究团队还发现，在HCMV的六聚体蛋白子单元内，存在大量的基因组DNA填充其内部通道。这也是其适应大基因组的一个重要机制。

六聚体通道内部充满基因组DNA，为病毒超大的基因组提供了额外的存储空间。与其他疱疹病毒相比，HCMV的DNA层之间的间距更密，显示其DNA的紧凑。

同时，六聚体通道内的DNA也起到分散和缓解脑膜内部压力的作用。减小了脑膜内部压强有利于提高其机械稳定性，使其不会因内压过大而破裂。

所以，通道内DNA的存在从两个方面提高了脑膜的稳定性，都有利于HCMV适应其巨大的基因组。这一发现揭示了该病毒脑膜稳定的分子机制。

综上所述，这些关于HCMV脑膜结构的重要发现，揭示了其适应巨大基因组压力的多种分子机制，为理解该病毒以及其他疱疹病毒的组装过程提供了重要线索。也为设计针对脑膜的防治策略奠定了结构基础。

目前，该研究团队核心成员所在的中科微末团队专注结构生物学成果转化，致力于为药企，AI4Science科技公司，和高校医院的科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率结构解析服务，助力创新药物研发和科研成果转化，用专业化系统化的服务，帮助科学家们实现“原子结构自由”。 在未来，希望在中国的生物学科、医学等相关领域，实现更长足的发展，并为人类的健康贡献一份力量。

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