SCI一区高分文章：解析梅毒如何“转”起来？

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前言

梅毒，一种由苍白（梅毒）螺旋体引起的性传播疾病。人类感染梅毒后，短期内会出现多种临床医学症状，包括原发性下疳；数周后会出现继发性梅毒皮疹，如果此时还未得到有效治疗，则可能会累及中枢神经系统和心血管系统。更糟糕的是，梅毒螺旋体有很长的潜伏期。在此期间，个体可以没有任何体征或症状，但可以保持高传染性；加上其免疫逃避的能力，梅毒常被称为“隐形病原体”。

如今，在临床医学方面，梅毒仍然是一种危害严重的性传播疾病。其中一期梅毒的治疗较为容易，但随着病情发展，螺旋体侵入全身器官，对身体的损伤程度将会迅速加重。同时，抗生素的滥用也加速了这一类螺旋体耐药性的产生，给传统基于小分子化合物的治疗带来困难，致使其致残和致死率增加。人类仍然需要用更多手段去了解梅毒，并由此拿出更有效的方法来制造新型药物、对抗梅毒。

而鞭毛，这种在细菌中较为常见的运动结构，在梅毒螺旋体的形态、运动和生物学中都起着至关重要的作用。活体的鞭毛有助于梅毒螺旋体在高度黏稠的胶状环境（比如人体内部结缔组织，即血液、细胞间环境等）中高效游动，以旋转的方式快速前进，使得这种神秘的细菌能够有效穿透组织并逃避宿主的免疫反应。另外，作为一种革兰氏阴性菌，梅毒的外膜组成更加多样，鞭毛结构也形成了相当复杂的体系。

在梅毒于人体内广泛迁移和加重病症的过程中，其结构独特的鞭毛发挥了重要作用。因此，想要探究梅毒如何获得这种高传播特性以及如何侵袭人体，了解其「鞭毛」这一“分子机器”的微观结构是十分重要的。来自休斯顿德克萨斯大学医学院的Steven J. Norris团队与加州大学洛杉矶分校（UCLA）微生物、免疫与分子遗传学研究所的周正洪教授团队合作，利用冷冻电子断层扫描（Cryo-ET，electron tomography）方法，研究了传染性苍白螺旋体（梅毒螺旋体）及其质周鞭毛的三维结构，提供了梅毒螺旋体细胞膜外结构的详细信息。相关文章发表在Journal of Molecular Biology上。

Cryo-ET不同于人们传统意义上用来解析「高分辨率」的生物大分子三维结构的“冷冻电镜单颗粒分析技术”Cryo-EM。这种处于蓬勃发展阶段的新技术基于断层扫描（CT，没错就是医院做的那个）的基本思路，能够在不破坏细胞完整性、不分离制备蛋白质组分的情况下，对于处在细胞原位的、能够反映真实完整细胞状态的分子及其复合物进行三维结构分析。Cryo-ET及其下属的子断层图像平均法STA（sub-tomogram average）正在将结构生物学引入解析柔性超大分子复合物结构、细胞原位蛋白及其他分子的复合结构等方向，应用范围覆盖蛋白复合物、病毒、细菌、细胞甚至组织。随着其分辨率的不断提高，这一技术正在逐渐成为结构学、细胞生物学乃至医学研究的重要利器。

梅毒螺旋体具有革兰氏阴性菌较为常见的外壁结构：外膜、细胞质膜和薄肽聚糖层，再往里则是被鞭毛包裹着的细胞体。其外膜是一个简单的脂质双分子层，表面可见连续的密度层，这一层可能是固定在细胞质膜上的质周脂蛋白；此外，还有小块的蛋白质从外膜的内小叶延伸出来。

图1 完整梅毒螺旋体结构，包括外膜(浅绿色)、细胞质膜(绿色透明)、鞭毛丝(蓝色)、锥形结构(粉色)和其他大分子复合物(黄色）

梅毒螺旋体的细胞包膜

梅毒螺旋体的外膜形态由周质鞭毛带调节，细胞质和外膜之间的间隙通常为23 nm，而在周质鞭毛（直径为20 nm）的附近会变得更宽（可达49 nm）。通过恰当的离心方法，研究人员在制样过程中去除了外膜，而没有破坏鞭毛和细胞本体之间的联系。在冷冻电镜的二维图像下，细胞质膜的周质侧附近表现出两层不同密度的结构：内层可能由从细胞膜延伸出来的不连续的一些离散颗粒组成，而外层则为细胞壁的肽聚糖层。

在这一部分，Cryo-ET扫描体现的结果证实了先前研究中认为“梅毒螺旋体外膜缺乏膜整合蛋白”的结论。而为了进一步研究梅毒螺旋体的表面结构，研究人员还将梅毒螺旋体涂在云母表面风干，并使用扫描探针显微镜（SPM）进行分析（这是一种能够提供物体表面三维结构的高分辨率成像技术，使用微小探针探测物体表面纳米尺度的结构信息，在材料科学比较常用）。SPM更加细微的探测结果显示了梅毒螺旋体表面具有一些未知的突起，而其中一些（直径约8 nm）位于质周鞭毛上的外膜。经过分析，研究人员考虑此为梅毒螺旋体较为罕见的外膜蛋白组分。

图2 细胞包膜结构 质周鞭毛(蓝线)脂蛋白层(紫色圆圈)和肽聚糖(橙色线)膜蛋白(橙色) CM(质膜)OM(外膜)PG（肽聚糖）

周质鞭毛

在肽聚糖层和外膜之间的则是从每个鞭毛马达延伸出来的鞭毛细丝，直径约为20nm。和一般人们印象中的细菌鞭毛不同，梅毒螺旋体区别于其他细菌群的一个最显著的特征便是其“内鞭毛”的存在形式（有时称为轴向丝）。换句话说，梅毒的鞭毛实际上生长在细胞外膜的“内侧”，位于细胞内膜和外细胞膜之间的周质空间内。内鞭毛沿着螺旋体的长度从细胞的顶端延伸向尾端，这样它们的旋转才会使细胞表面的螺旋凸纹不断伸缩移动，推动细胞以拔塞钻状快速前进。

图3 质周鞭毛和细胞质丝

冷冻电镜显示，梅毒螺旋体的鞭毛细丝通常平行排列，每个细丝都与其他细丝密切关联。大多数样本(86%)每一端都有三个鞭毛，少数则有两个或五个。免疫胶体金（使用金颗粒标记的抗体结合到目标蛋白上，在电镜下能显示出特定蛋白被标记的位置）显示，较粗的细丝（直径20nm）可能由FlaB蛋白构成核心，而FlaA蛋白组成表面；而较细的细丝（直径13nm）则仅由FlaB蛋白组成。

研究人员进一步利用冷冻电镜照片，使用断层成像的办法分析了较粗的鞭毛细丝在细胞原位的结构。粗鞭毛细丝从内到外可以大体分成两部分：一个内层的中空柱体（图4，浅蓝色），和一个分布在外层的螺旋网络（深蓝色）。外部的网状密度层表现为左旋、五起始点、晶格状的螺旋结构（图4，三维结构和横截面），螺距为6 nm。内侧柱体（白色虚线）及其中空管道的直径分别为11 nm和5.6 nm。正如前面所说，粗鞭毛的外层网格状鞘由FlaA蛋白组成，通过一个狭窄的密度区域与核心相连；内部“核心”则是在每个截面上由5个密度较高的区域组成，这可能就是之前推测的FlaB蛋白部分。

图4 冷冻电镜断层扫描方法（Cryo-ET）得到的鞭毛三维图像

发现新的大分子集合体：锥形结构

该研究在每个梅毒螺旋体的末端都发现了一个锥形结构。从内外厚度上看，这一“锥形结构”位于相对远离细菌本体的肽聚糖层外、外膜附近，距离细胞膜约100 nm。研究者根据图像推测，这一结构可能是一种或多种蛋白质(很可能包括至少一种脂蛋白)沿着外膜的内表面排列形成的螺旋状或环状稳定结构，这些相邻蛋白阵列间的纵向间距约为5nm。锥形结构的内部则相对无定形，密度分布的差异并不明显。

图5 冷冻电镜为锥形结构提供了更多的结构细节

鞭毛马达及其三维重构模型

鞭毛马达在细菌中负责通过蛋白质的协同作用将细胞的能量转化为鞭毛转动的动能，是至关重要的“动力源”结构。在梅毒螺旋体中，这一马达也具有较为复杂的分子组成。

Cryo-ET显示，梅毒螺旋体的多个鞭毛马达通常分布在细胞体的两端。其马达的中心部分延续了经典的革兰氏阴性菌结构，包括如钩形鞘、中央杆、MS环、定子（rotor）、C环和输出结构等蛋白质组分。值得一提的是，梅毒螺旋体的马达中不包括比较经典的P环，说明这一结构对螺旋体细胞的鞭毛转动并不是必要的。

钩形鞘结构位于马达顶部，连接在中央杆上；中央杆穿过细胞膜，在下方与MS环对接；在MS环的细胞质侧，可见位于中心的输出结构；MS环的外围是由FliG等蛋白组成的C环；钩形鞘和中央杆的外围则是定子，它由膜相关蛋白MotA和MotB组成，并嵌入细胞质膜中。Mot蛋白实际上起氢离子通道的作用，它能够将细菌“奋力维持”的跨膜离子梯度转化为鞭毛马达的转动能量。

图6 鞭毛马达的Cryo-ET重组结构，和经典的示意图对比

总结而言，这一研究的高分辨率低温断层扫描重构实验揭示了梅毒螺旋体的未被报道过的包膜结构细节，表现了Cryo-ET非常适合在分子水平上阐明完整生物体的三维细胞结构，使得细胞中的微小结构例如膜相关蛋白层得到可视化，有助于验证许多先前的理论研究中螺旋体外膜的结构模型。并且，该研究提供了第一个梅毒螺旋体周质鞭毛的超微结构，证实了FlaB1或FlaB2对鞭毛运动的重要性；除此之外，本文还详细说明了鞭毛周围的细胞模型，指出肽聚糖层不仅维持了细胞壁的完整性，而且作为鞭毛与细胞壁之间的连接接口，承受了梅毒螺旋体鞭毛快速旋转时所产生的摩擦和扭矩，防止本身极为脆弱的螺旋体由于运动死亡。这些发现对于明确梅毒螺旋体-宿主相互作用的原理、致病机制以及对梅毒疫苗、药物研发、临床治疗手段的开发具有重大意义，也为其他病原微生物的微观结构研究开创了新的方向。

中科微末团队在使用Cryo-ET和Cryo-EM等多种技术解析生物大分子及其复合物的三维结构方面技术成熟、经验丰富，能够在近原子级分辨率解析多种生物大分子材料的三维结构，为您提供“眼见为实”的结构信息。我们致力于为药企和高校医院科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率的结构解析服务，助力创新药物研发和科研成果转化，帮助科研人员实现“原子结构自由”。

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